华人学者开发非侵入光化遗传学技术照亮中风治疗前景《资讯》

07-22

移植神经祖细胞以恢复失去的大脑神经元功能，是一种很有希望的中风患者康复策略。日前，埃默里大学（Emory University School of Medicine）的研究人员开发了一种名为光化遗传学（optochemogenetics）的技术，通过在大脑细胞表面创造一种发光蛋白，成功让大脑神经元发光。该技术可以不用开颅，以非侵入方式在大脑内产生光刺激，从而诱导移植神经祖细胞的生长和分化。这项最新成果于本月初发表在 Journal of Neuroscience 上。

虽然移植神经祖细胞是一种很有希望的中风患者康复策略，但是干细胞移植也面临着诸多问题，尤其是这些移植的神经祖细胞需要一定的刺激和诱导，才能实现大脑受损功能的恢复。而为了向移植的干细胞提供这种帮助，研究人员希望通过这种改进版的光遗传学（optogenetics）技术，可以不用开颅，以非侵入方式在大脑内产生光刺激，从而诱导移植神经祖细胞的生长和分化。

在中风小鼠实验中，研究人员通过基因工程技术，将编码发光蛋白和感光蛋白的基因引入诱导多能干细胞，培养形成神经祖细胞后植入小鼠大脑，然后通过绕过血脑屏障的鼻内递送荧光素酶底物，激活脑内细胞表面发光蛋白产生光刺激，从而选择性地诱导神经祖细胞的增殖、分化。

结果显示，与未接受刺激的干细胞相比，这种名为光化遗传学的新型非侵入性技术能够让植入的干细胞变得更健康，形成更多的神经连接，中风小鼠的大脑也显示出最大的恢复，一些行为和症状成功恢复到中风前水平。

（来源：EPFL, Human Brain Project）

论文第一作者、埃默里大学医学院麻醉科终身教授于山平在接受 DeepTech 采访时表示，“这项研究对于目前普遍的在细胞移植后对移植细胞置之不理的做法是一个突破。”考虑到光在人脑中的非常有限的传播和光源植入的有创性，光遗传学的广泛临床应用几乎是不太可能的，而光化遗传学这种无创性的持续干预疗法，可以说是带有革命性的改进，多个行为学的结果也证明，中风小鼠的多项指标可恢复到正常水平。

当中风迎来干细胞治疗

中风是影响人类健康的最主要风险因素之一，也是造成当今中国人口死亡的头号病因。和心脏病发作等其它缺血性疾病一样，脑中风是由血管阻塞而阻碍血液流向大脑组织所致。

中风和心脏病发作时，缺血和缺氧分别会造成大脑神经元和心肌细胞不可逆转的损伤和死亡。以中风为例，往往突然发作，出现昏倒、半身不遂、口舌歪斜等症状，具有极高的病死率和致残率。尽管人们对于中风发生机制的了解越来越深，但目前仍然缺乏有效的治疗药物，逆转缺血性中风对大脑造成的不可逆损伤。

图 | 中风（来源：The Lancet）

近年来，随着干细胞技术的不断发展，细胞移植等再生疗法为脑损伤后的组织修复和功能恢复提供了一种有前景的策略。

2006 年，日本科学家山中伸弥（Shinya Yamanaka）成功将成体细胞转变为诱导多能干细胞（induced pluripotent stemcells，iPSC），并因此而获得 2012 年诺贝尔生理或医学奖。

由于其易获得性、分化潜能和临床相关性，诱导多能干细胞技术的出现，极大地推动了干细胞和再生医学的发展，特别是为神经系统疾病的再生治疗带来了光明前景。在中风动物模型中，移植由诱导多能干细胞分化的神经祖细胞，已经显示出具有细胞替代、营养支持增加和功能改善的潜力。

图 | iPSC 衍生的神经元（来源：uq.edu.au）

不过，干细胞治疗并非将干细胞移植到受损组织，然后静观其变那么简单。在神经细胞再生治疗过程中，移植神经祖细胞的受控生长和分化，以及与现有神经回路的重新连接，仍是十分关键的步骤和挑战。

就像发育过程中大脑未成熟的神经元一样，移植到成人大脑中 iPS 细胞衍生的神经祖细胞，其命运和功能表型取决于移植部位的微环境。神经电活动和由此产生细胞信号，是影响神经祖细胞分化的关键因素。因此，在干细胞移植后，适当的刺激和诱导，对于神经元分化和成熟、细胞存活，以及神经突出的可塑性和特定功能形成至关重要。

在这项最新研究中，研究人员认为，对移植细胞的选择性刺激，可以在中风的大脑组织中为神经网络再生和功能恢复提供良好的微环境和条件，以保障和提高细胞的存活、分化、营养因子合成分泌、突触形成和网络连接。

“仅仅把这些细胞植入受损的大脑，然后不管不问是不够的。如果我们期望祖细胞分化成功能性神经元，这些细胞就必须接受模仿它们在大脑中的刺激，还需要合适的生长因子和支持下环境。”于山平教授表示。

大脑说：要有光！

但是，面对复杂且精密的大脑神经元，想要实现对其生长和分化的精确操控，科学家们一时也无从下手。这个时候，就需要一种革命性技术的出现。

2005 年，斯坦福大学 Karl Deisseroth 实验室发明的光遗传学（optogenetics）技术，就彻底改变了神经科学领域。光遗传学技术是通过基因工程技术将光感蛋白基因转入特定类型的神经细胞，使其在神经细胞表明形成光感离子通道，在不同波长的光照刺激下，光感离子通道会对细胞膜阳离子或阴离子的通过产生选择性，从而实现对神经元选择性兴奋或抑制的目的。

可以说，光遗传学技术使得科学家们仅通过光照，就能实现对神经元毫秒级的操控，不仅为深入理解大脑奥秘、神经系统疾病机制提供了革命性工具，也为多种复杂疾病的治疗带来了光明前景。光遗传学技术也被认为是将获诺奖的热门技术之一。

图 | 光遗传学技术（来源：Stanford University）

虽然光遗传学技术为在复杂神经回路环境下精确操纵神经活动，提供了前所未有的能力，但光照传递仍然是限制其在体内临床应用的主要障碍。当进行体内试验时，如何向大脑深部进行光传递，就成了摆在科学家面前的技术挑战。

当前将光传输到大脑最常见的解决方案，是通过手术植入的光纤与外部光源耦合。但是，这些长期植入的光纤不仅会带来感染和组织损伤的风险，而且在自由移动的动物身上进行实验，还会增加不少实际障碍。由于光线的散射和组织的吸收，外部光线通过大脑的传输效率也非常低。事实上，大多数从植入的光纤发出的光，在光纤尖端1毫米内就完全衰减。

“光遗传学是一种极好的技术工具，但它在临床应用中存在一些障碍。”于山平教授表示，“光纤传输具有侵入性，而且光的传播距离有限，尤其是在更大范围的人脑内。”

光遗传学在心脏等其他组织的应用，也面临着类似的挑战。虽然在开发需要更少光照的光遗传学工具（即更敏感和红移的光感蛋白）方面已经取得了进展，但这种方法在非人类灵长类动物或人类患者身上的可扩展性仍不清楚。

为此，埃默里大学医学院和乔治亚理工学院的研究人员开发了一种光化遗传学技术，具体而言，他们创造了一种光化学复合蛋白（luminopsin），作为激活光感蛋白的替代光源。这种“发光蛋白”，来源于生活在深海中的藻类和海洋桡脚类动物（Gaussia princeps），其能够在一种化学底物荧光素CTZ （coelenterazine）存在时发出生物荧光。

图 | 荧光素酶（Gluc）与荧光素（CTZ）结合发光，激活光感蛋白（ChR）（来源：Shan Ping Yu）

由于这种发光蛋白可以通过基因编码，并与光感蛋白一起以细胞特有的方式表达，于是，在这项最新研究中，研究人员将编码发光蛋白的基因导入诱导多能干细胞中，然后培养成神经祖细胞，并植入中风一周的小鼠大脑中。

然后，在接下来的两周内，研究人员每天两次通过鼻内给药的形式，向小鼠大脑提供荧光素 CTZ。于山平指出，经鼻给药绕过了血脑屏障，这种非侵入性的重复给药方式在临床上是可行的。

当 CTZ 遇到发光蛋白时，会发出所需的光线。实验监测显示，在 CTZ 给药后 1 小时左右，细胞移植区域出现生物荧光。

通过让发光蛋白和光感蛋白同时表达在神经元细胞表面，然后通过外界化学物质的递送，为大脑内部光遗传学操控提供所需的光源，这一策略在小鼠实验中取得了一系列积极作用。

图 | 移植的干细胞在刺激后成长为健康的神经元（来源：Ping Yu et al., JNeurosci 2019）

实验结果显示，神经祖细胞生长和分化的存活率大幅提高，产生更多完整的轴突和神经连接，以及对电刺激更好的反应。小鼠受影响的肢体也出现了更好的恢复，在幼鼠中，可以使中风影响肢体的功能恢复到正常水平，甚至在老年小鼠中，也能使中风症状部分恢复。

对于该技术的临床前景时，于山平表示，由于光化遗传学技术的无创特点，临床应用应该有比较广泛的前景。“我认为经过必要的毒副作用安全实验后，任何特殊的细胞群和脑区都可以在表达抑制型或兴奋型的光化学复合蛋白后，经外周给药的方式进行可控的刺激。当然，具体疗效还要看今后的临床前研究和临床实验的结果。”

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